SkinEthic Labotories

試験の説明

光毒性試験


再生組織モデル


プロトコールの原理


この試験の目的は、スキネティックin vitro再生ヒト表皮モデルに、24時間、局所投与後の試験製品の相対的な光毒性ポテンシャルを判定する事にある。


試験手順の詳細

試験方法



試験物質とポジティブコントロールを6個の再生ヒト表皮組織の角質層表面 (サイズ 0.5 cm²) に塗布する。全組織(6個の未処置の組織を含む)を、37度、5% CO2 で24時間培養する。試験終了時に、3個の組織は、6J/cm² のUVA (Solar Simulator BIOSUN、Vilber Lourmat、France) で照射する。他の3個の非照射組織は、室温で暗所に保存する。照射後、試験物質を洗浄除去し、組織を37度、5% CO2 で、さらに24時間培養する。培養後、2個の照射組織と2個の非照射組織は、MTT を用い細胞生存性を評価する。他の組織は、組織学(H&E染色)を評価する。
 
試験製品がクリームと液体の場合では、塗布量とポジティブコントロールが異なる
- クリームの場合:2.5µlの試験製品を塗布する;ポジティブコントロール:Phenergan (Rhone Poulenc)
- 液体の場合:80µlの試験製品を投与する;ポジティブコントロール:クロールプロマジン0.005%


細胞生存性の評価(MTT 試験)


各試験コンディションにつき、2個の組織を300 µl の0.5 mg/ml MTT溶液に移し、37度、5% CO2で、3 時間培養する。フォルマザン抽出は、1.5 ml のイソプロパノール溶液中で、室温で、最低2時間行なう。吸光度(OD)を570 nmで測定する。
結果は、ネガティブコントロールと比較した生存性の%として表わされる:
細胞生存性% = [OD (570nm) 試験物質 / OD (570nm) ネガティブコントロール)] x 100


組織学


各試験コンディションにつき、1個の組織を10%緩衝フォルマリン溶液で固定し、パラフィンに包埋する。4ミクロンの垂直切片をヘマトキシリン/エオジンで染色し、顕微鏡下で写真を撮る。


参考文献

Assessment of the phototoxic potential of compounds and finished topical products using a human reconstructed epidermis. J. Medina, C. Elsaesser, V. Picarles, O. Grenet, M. Kolopp, S Chibout, and A. de Fraissinette. In Vitro & Molecular Toxicology, Vol. 14, n°3, p.157-168, 2001.
 
Development of a highly sensitive in vitro phototoxicity assay using the SkinEthic reconstructed human epidermis. F-X. Bernard, C. Barrault, A. Deguercy, B. De Wever, M. Rosdy. (1) BIOalternatives, Genēay, France. (2) SkinEthic Laboratories, Nice, France. Cell Biology and Toxicology, Vol. 16,6, p.391-400, 2000.
 
UVA effects on reconstituted human epidermis (SkinEthic®): new developments in the determination of the phototoxic potential of cosmetic raw materials. De Wever B., Cappadoro M., Deguercy A., and Bernard F-X., SkinEthic, Nice France; BIOalternatives, Gencay, France. Cosmetics & Toiletries Manufacture Worldwide, 221-227, 1999.